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31 de outubro de 2013

Métodos laboratoriais – PCR

Reação em cadeia de polimerase – Polymerase Chain Reaction (PCR)

Reação em cadeia de polimerase (PCR) é um método de produção de um grande número de cópias de trechos pequenos de DNA a partir de amostras muito pequenas de material genético. O método também é chamado “amplificação” do DNA e permite detectar e medir genes específicos.

O DNA é composto por sequências de quatro bases – adenina, timina, guanina e citosina. Estão dispostas em duas cadeias ligadas entre si por pontes de hidrogênio que formam uma hélice dupla semelhante a uma escada em espiral. Cada metade da hélice é complemento da outra. A sequência específica das bases forma o material genético de um indivíduo e é usada para produzir RNA, que, por sua, vez produzproteínas. Há cerca de 25.000 genes no genoma humano, cuja expressão orienta a produção das proteínas que formam o corpo. Todos os seres vivos, incluindo bactérias e vírus, têm estruturas análogas de DNA, com exceção de alguns vírus em que o RNA substitui o DNA.

Como o método é executado?

A PCR se constitui de diversos passos ou “ciclos” em um instrumento chamado termociclador, que aumenta e diminui a temperatura da amostra em intervalos definidos durante o procedimento.

  1. O primeiro passo separa as duas cadeias de DNA aumentando a temperatura da amostra. É chamado desnaturação do DNA.
  2. Depois de separadas as cadeias, a amostra é esfriada um pouco e são adicionados iniciadores (primers), que são sequências de DNA complementares do início ou do fim da área a ser amplificada.
  3. Depois que os primers se ligam a cada cadeia de DNA, é adicionada uma enzima (em geral, a polimerase Taq), que acrescenta bases às duas cadeias separadas e forma duas cadeias duplas iguais à original a partir dos primers. A polimerase Taq é extraída de uma bactéria (Thermus aquaticus) encontrada em água muito quente de fontes térmicas e gêiseres. Ela é especialmente útil porque não é destruída em temperaturas altas, como a maioria das enzimas comuns.
  4. O processo é repetido com as duas cadeias duplas formadas, gerando quatro cadeias novas. Assim, a cada ciclo é dobrado o número de cadeias presentes na amostra.
  5. Após 30 a 40 ciclos, são produzidas bilhões de cópias do DNA original, quantidade suficiente para uso em testes diagnósticos moleculares. Todo o processo é automatizado, e dura algumas horas.

Como é usado?

Esse método pode ser usado para detectar genes no DNA de uma pessoa, como os associados a câncer ou a distúrbios hereditários, ou para detectar e quantificar material genético e bactérias ou vírus infecciosos.

Abaixo estão alguns exemplos de exames laboratoriais que usam PCR:

PCR após transcrição reversa (Transcriptase reversa – PCR)

Esse método usa a PCR para amplificar o RNA viral, que é encontrado como uma cadeia única e precisa e é transcrito em DNA antes de ser amplificado. Essa transcrição é feita pela enzima transcriptase reversa e um primer. A enzima copia o RNA formando uma cadeia urina de DNA, que depois é duplicada. Esse DNA de cadeia dupla pode, então, ser amplificado por PCR. A detecção pode ser feita também em tempo real.

Dois exemplos de métodos que usam transcriptase reversa e PCR:

Fontes

(February 27, 2012). Polymerase Chain Reaction (PCR). National Human Genome Research Institute [On-line information]. Available online at http://www.genome.gov/10000207 through www.genome.gov. Accessed August 2012.

Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, eds. St. Louis: Elsevier Saunders; Fifth edition, 2011, Pp 1412-1413.

Clarke, W. and Dufour, D. R., Editors (2006). Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Pp 135-137.